Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤

Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事变:

高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法

液相色谱柱使用及保养

高压液相色谱HPLC培训教程(一)

高压液相色谱HPLC培训教程(七)

高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁和再生

HPLC对流动相的基本要求

高效液相色谱

Waters 600E-2487HPLC系统SOPWaters高效液相色谱系统操作规程

高效液相色谱仪(Agilent 1100)操作注意事变

色谱扫盲班

Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤

(一)、开机:

1、打开计算机,进入Windows NT(或Windows 2000)画面,并运行Bootp Server程序。

二、打开1100LC各模块电源。

3、待各模块自检完成后,双击Instrument 1Online图标,化学工作站自动与1100LC通讯,进入的工作站画面。

四、从"View"菜谱中选择"Method and Run control"画面,单击"View"菜谱中的"Show Top Toolbar","Show status toolbar","System diagram","Sampling diagram",使其命令前有"√"标志,来调用所需的界面。

5、把流动相放入溶剂瓶中。

6、打开Purge阀。

7、单击Pump图标,出现参数设定菜谱,单击Setup pump选项,进入泵编辑画面。

8、设Flow:5ml/min,单击OK。

9、单击Pump图标,出现参数设定菜谱,单击Pump control选项,选中On,单击OK,则系统开始Purge,直至管线内(由溶剂瓶到泵进口)无气泡为止,切换通道继续Purge,直至所有要用通道无气泡为止。

10、单击Pump图标,出现参数设定菜谱,单击Pump Control选项,选中Off,单击Ok关泵,封闭Purge valve。

11、单击Pump图标,出现参数设定菜谱,单击Setup pump选项,进入Pump编辑画面,设Flow:1.0ml/min。

1二、单击泵下面的瓶图标,输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击Ok。

(二)数据收罗方法编辑:

1、开始编辑完备方法:

●从"Method"菜谱中选择"Edit entire method"项,如上所述图所示选中除"Data analysis"外的三项,单击Ok,进入下一画面。

二、方法信息:

●在"Method Comments"中插手方法的信息(如:方法的用途等)。

●单击Ok进入下一画面。

3、泵参数设定:(以二元泵为例)

●在"Flow"处输入流量,如1ml/min,在"Solvent B"处输入70.0,(A=100-B),也可Insert一行"Timetable",编辑梯度。在"Pressure Limits Max"处输入柱子的最大耐高压,以保护柱子。

●单击Ok进入下一画面。

四、自动进样器参数设定:

●选择合适的进样方式,进样体积1.0ul,洗瓶位置为6号。"Standard Injection"--只能输入进样体积,此方式无洗针功能。"Injection with Needle Wash"--可以输入进样体积和洗瓶位置,此方式针从样品瓶抽完样品后,会在洗瓶中洗针。"Use injector program"---可以点击Edit键举挺进样程序编辑。

●点击Ok进入下一画面。

5、柱温箱参数设定:

●在"Temperature"下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击"more"键,如图所示,选中"Same as left"---使柱温箱的温度左右相符。

●点击ok进入下一画面。

6、VWD检测器参数设定:

●在"Wavelength"下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm,在"Peak width(Response time)"下方点击下拉式三角学框,选择合适的响应时间,如0.1min(2s)。

●在Timetable中可以"Insert"一行,输入随时间切换的波长,如1min,波长=300nm。点击ok进入下一画面。

7、DAD检测器参数设定:

●检测波长:254nm,BW=30nm,参比波长=350nm,BW=100nm;

●检测波长:一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW:一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长:一般选择在接近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽BW:至少要与样品信号的带宽相称,很多情况下用100nm作为缺省值。Peak width(Response time):其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit-狭缝窄,光谱分辨率高;宽时,噪音低。同时可以输入收罗光谱方式,步长,范围,阈值。选中所用的灯。

●点击Ok进入下一画面。

8、RID检测器参数设定:

●色谱前提:

进样体积:20ul。光学单元温度:Off。

极性:正。峰宽(响应时间):4s。

●"Optical Unit Temperature"---若环境温度控制在±2℃,设定为Off,若环境温度不不变,则设定光学单元温度为高于环境温度5度,以防样品在池中沉淀。"Peak width"---大多数分析设为4S,只有在高速分析下设为更短。"Automatic recycling after analysis"---在不举行分析时可以让流动相循环,节省流动相,检测器连续运行,可随时投入使用。

●点击RID图标,选择RID Control:Heater设为On,若要循环流动相,必须将"Recycling Valve"设为ON。手动purge参比池,将其设为On,并输入Purge时间。

9、FLD检测器参数设定:

色谱前提:

●样品:P/N 01018-68704用甲醇稀释为1:10。

●进样体积:5ul。

●柱温箱:30℃。EX=246nm,EM=317nm,PMT=10。

●响应时间=4s.停止时间:出峰完毕。

●Excitation A:激发波长:200-700nm,步长为1nm,或Zero Order。

●Emission:发射波长:280-900nm,步长为1nm,或Zero Order。

●PMT:大多数应用适当的设定值为10,若高浓度样品峰被切男子发式,则减少PMT值。

●"Peak width":大多数应用设为4s,只有快速分析采用小的设定值。

●Multi Ex:多波长及光谱(激发)。

●Multi Em:多波长及光谱(发射)。

●同时可以输入范围Range、步长step、收罗光谱。

10、在"Run time checklist"中选中"Data acquisition",单击Ok。

11、单击"Method"菜谱,选中"Save method as",输入一方法名,如"test",单击Ok。

1二、从菜谱"View"中选中"Online signal",选中Windows 1,然后单击Change钮,将所要画图的信号移到右边的框中,点击Ok.(如同时检测二个信号,则重复12,选中Windows 2)。

13、从"Run control"菜谱中选择"Sample info"选项,如上所述图所示,输入操作者名称,在"Data file"中选择"Manual"或"Prefix"。

区别:Manual--每一次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。Prefix-在Prefix框中输入前缀,在Counter框中输入计数器的肇始位,仪器会自动命名,如vwd0001,vwd0002…。

1四、从Instrument菜谱选择System on。

15、等仪器Ready,基线平稳,从Method菜谱中选择"Run method",进样。

(三)、数据分析方法编辑:

1、从"View"菜谱中,单击"Data analysis"进入数据分析画面。

二、从"File"菜谱选择"Load signal",选中您的数据文件名,如下图所示。单击Ok。

3、做谱图优化,从"Graphics"菜谱中选择"Signal options"选项,。从Ranges中选择Auto scale及合适的显示时间,单击ok,或选择"Use Ranges"调整。反复举行,直至图的比例合适为止。

四、积分:

⑴、从"Integration"中选择"Auto integrate",如积分成果不理想,再从菜谱中选择"Integration Events"选项,选择合适的Slope sensitivity,Peak width,Area reject,Height reject。

(2)、从"Integration"菜谱中选择"Integrate"选项,则数据被积分。

(3)、如积分成果不理想,则修改相应的积分参数,直至满意为止。

(4)、单击左边"√"图标,将积分参数存入方法。

5、打印报告:

⑴、从"Report"菜谱中选择"Specify report"选项,进入如上所述画面。

(2)、单击"Quantitative Results"框中Calculate右侧的黑三角学,选中Percent(面积百分比),其它选项不变。

(3)、单击Ok.

(4)、从"Report"菜谱中选择"Print report",则报告成果将打印到屏幕上,如想输出到打印机上,则单击Report底部的"Print"钮。

(四)、关机:

●关机前,用100%的水冲洗系统20分钟,然后用有机溶剂冲洗系统10分钟(如ACN),然后关泵,(适于反相色谱柱)。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]

●退出化学工作站,及其它窗口,封闭计算机(用shut down关)。

关掉Agilent 1100电源开关。

Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事变:

1、色谱柱长时间不用,存放时,柱内应充满溶剂,两端封死(如ACN适于反相色谱柱,正相色谱柱用相应的有机相)

二、对于手动进样器,当使用缓冲溶液时,要用水冲洗进样口,同时挪动转移进样阀数次,每一次数毫升。

3、流动相使用前必须过滤,不要使用多日存放的蒸馏水(易长菌)。

四、带seal-wash的1100,要配制90%水+10%异丙醇,以每一分2-3滴的速度虹吸排出,溶剂不能干涸。

5、其它主意事变见说明书,或由现场工程师介绍。

维护知识问答

1、为什么溶剂和样品要过滤?

溶剂和样品过滤非常重要,它会对色谱柱、仪器起到保护作用,消除由于污染对分析成果的影响。

色谱柱:由于填料颗粒很细,色谱柱内腔很小,溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。

仪器:溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨耗,同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨耗。

样品过滤头的类型:

30mm内径:合用于大进样量的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。

13mm内径:合用于范围广的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。

3mm内径:合用于小进样量的过滤,由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。

滤膜类型:

聚四氟乙烯滤膜:合用于所有溶剂,酸和盐,并无任何可溶物。

醋酸纤维滤膜:不合用于有机溶剂,特别合用于水基溶液,推荐用于蛋白质和其相关样品。

尼龙66滤膜:合用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可用于强酸,70%乙醇、二氯甲烷、不合用于二甲基甲酰胺。

再生纤维素滤膜:具有蛋白吸收低,同样合用水溶性样品和有机溶剂。

二、为什么HPLC用缓冲盐时要加在线Seal-wash选项?

HPLC用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象,析出的细小盐粒非常结实又硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕,并磨耗弥缝垫,造成漏液等故障现象。在线Seal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。缓冲盐的浓度在0.1mol或大于0.1mol时,必须使用该在线冲洗选项.

清洗液配制:90%水+10%异丙醇.该混合液可抑制菌类生长和减小水的外貌张力。以2-3滴/min的速度虹吸流下,不能干涸。

3、为什么Agilent 1100LC的流动相管路非常细?

在使用HPLC时,应特别注意"柱外效应"对分析成果的影响,由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~五个数量级,液体流动相的流速也比气相慢1-二个数量级。因此,样品进入色谱柱后,在柱子以外的任何死体积(进样器、柱接头、毗连管、检测器)中,样品分子的扩散和停留不动,城市引起色谱峰的展宽,而使柱效降低。为使柱外效应减之最小,获患上理想的分析成果,Agilent 1100LC使用加工工艺困难程度高的毛细管线作为流动相管路。

毛细管线分类:0.17mm内径--绿色;0.12mm内径---红色。

PEEK管线:内径---0.13mm;0.18mm;0.25mm;0.5mm。

毛细管线优点:柔韧性好.

*Agilent公司同时备有1/16in的粗外径毛细管线,合用于不同习气的用户,优点是刚性好,但柔韧性差一些。

四、流动相使用前为什么要脱气?

流动相使用前必须举行脱气处理,以除去其中溶解的气体(如O2),以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时,因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音,造成灵敏度降落,甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化,柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD,可能会造成荧光猝灭。

经常使用的脱气方法比较:

氦气脱气法:利用液体中氦气的溶解度比空气低,连续吹氦脱气,效果较好,但成本高。

加热回流法:效果较好,但操作复杂,且有毒性挥发污染。

抽真空脱气法:易抽走有机相。

超声脱气法:流动相放在超声波容器中,用超声波振荡10-15min,此法效果最差。

在线真空脱气法:Agilent1100LC真空脱机利用膜渗入技术,在线脱气,智能控制,无需额外操作,成本低,脱气效果明显优于以上几种方法,并合用于多元溶剂体系。

5、怎样防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞,以及堵塞后的处理?

溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器,从而影响泵的运行,尤其水溶液或磷酸盐缓冲液(PH=4-7)。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。

A:请严格执行溶剂过滤。

B:请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液

C:如果应用许可,可在溶剂中插手0.0001---0.001M的叠氮化钠.

D:在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。

E:避免使溶剂瓶袒露在直射太阳光下,尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。

堵塞后的处理法方法:将过滤头从组件中取下,在浓硝镪水(35%)中浸泡1h,然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。

6、Agilent 1100LC泵怎样维护?

Agilent 1100LC泵给色谱柱提供不变、无脉动、流量精确的流动相,及时合理的维护非常重要。

A:流动相使用前请必须脱气、过滤。

B:使用缓冲盐时,要加在线Seal-wash选项。

C:关机前,用100%的水冲洗系统20分钟,然后用有机溶剂冲洗系统10分钟(如甲醇),然后关泵,(适于反相色谱柱)。[正相色谱柱用适当的溶剂冲洗]

D:及时改换Purge Valve内的过滤芯。(当打开Purge Valve时,压力高于10bar,表明过滤芯已堵)。E:使用合适的弥缝圈。

7、怎样选择合适的泵头活塞弥缝圈?

泵头活塞的标准弥缝圈能合适于大多数应用,但使用正相溶剂(如正己烷),不合适使用标准活塞弥缝圈,特别是长时间使用时,需改换另一种不同的弥缝圈,我们建议使用聚四氟乙烯弥缝圈。(p/n0905-1420 2/pk)

*注意:聚四氟乙烯弥缝圈的压力范围为:0-200bar;建议在泵的压力限制中,将最大压力设为200bar。

8、使用梯度比例发时要注意那一些事变?

当盐溶液与有机溶剂溶液混合时,盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶,而不会出现沉淀。可是在比例阀的混合点,重力作用使盐颗粒沉淀下来,通常,阀A接水相/盐溶液,D接有机溶剂,此法毗连可有效使盐回落到盐溶液中,并被溶解。若颠倒过来,盐可能落在有机溶剂中,出现问题。

强烈建议:当使用缓冲盐溶液和有机溶剂时,推荐将缓冲盐通道接在A通道上,有机溶剂通道直接接在A通道的上方D通道上;定期用水冲洗所有的通道,以除去阀口上可能出现的盐沉淀。

9、在线真空脱气机使用要注意那一些事变?

一般来讲,Agilent 1100LC的真空脱气机无需过多维护,只需注意几个注意事变就可以了。

A:第一次使用,要用随仪器附带的注射器抽满脱气有机体腔;改换不同类型的溶剂时,要先抽闲,再抽满。

B:不用的通道要充满溶剂或严密封闭起来。

10、改换色谱柱时要注意什么事变?

在使用HPLC时,应特别注意"柱外效应"对分析成果的影响,由于样品分子在液体流动相中的扩散系数比在气体中小4~五个数量级,液体流动相的流速也比气相慢1-二个数量级。因此,样品进入色谱柱后,在柱子以外的任何死体积(进样器、柱接头、毗连管、检测器)中,样品分子的扩散和停留不动,城市引起色谱峰的展宽,而使柱效降低。为使柱外效应减之最小,获患上理想的分析成果,仪器的流动相管路毗连非常重要,一般Agilent 1100LC在第一次安装时,均有受过专业培训的安装工程师卖力安装,各类接头会处理的非常完美。客户只需在改换色谱柱时注意接头处理就可以了,一般柱子进口接头为不锈钢卡套接头,柱子出口为不锈钢卡套接头或PEEK管线手拧街头,当完成第一次安张后,不锈钢卡套已固定死,当接不同的柱子时,要注意柱子接头处的形状和长度,否则会产生一个非常大的死体积。

11、手动进样阀需做那一些维护,使用时要注意什么?

对于手动进样器,当使用缓冲溶液后,或进浓度差异比较大的样品时要用专用工具而不是用带针头的注射器冲洗进样口,同时挪动转移进样阀数次,每一次数毫升。

注意事变:

●安装时六通阀的5,6出口要与注射器在同一水平线上,以防止虹吸现象的发生,导致进样量的重复性变异。

●进样量的几多要根据定量管的LOOP体积决定。

当样品量少时:进样体积由注射器的进样体积决定,但最大进样体积要小于1/2loop体积。

当样品量较多时:进样体积由定量管的体积决定,为保证样品完全把定量管的流动相置换干净,需注射5-6倍的LOOP体积。

●要使用专用的液相注射器进样,绝对不可以用气相的注射器。

高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法

诊状

(一)保留时间变化

可能的原因:解决方法

1.柱温变化:柱恒温

2.等度与梯度间未能充分平衡:至少用10倍柱体积的流动相平衡柱

3.缓冲液容量不够:用25mmol/L的缓冲液

4.柱污染:每一天冲洗柱

5.柱内前提变化:不变进样前提,调节流动相

6.柱快到达生存的年限:采用保护柱

(二)保留时间缩短

可能的原因:解决方法

1.流速增加:查抄泵,重新设定流速

2.样品超载:降低样品量

3.键合相流失:流动相PH值保持在3~7.5查抄柱的方向

4.流动相组成变化:防止流动相蒸发或沉淀

5.温度增加:柱恒温

(三)保留时间延长

可能的原因:解决方法

1.流速降落:管路泄漏,改换泵弥缝圈,排除泵内气泡

2.硅胶柱上活性点变化:用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱

3.键合相流失:同前(二)3 4.流动相组成变化:同前(二)4 5.温度降低:同前(二)5

(四)出现肩峰或分叉

可能的原因:解决方法

1.样品体积过大:用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%

2.样品溶剂过强:采用较弱的样品溶剂

3.柱塌陷或形成短路通道:改换色谱柱,采用较弱腐蚀性前提

4.柱内加热使黏结不锈钢失效:改换加热使黏结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品

5.进样器损坏:改换进样器转子

(五)鬼峰

可能的原因:解决方法

1.进样阀残余峰:每一次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗

2.样品中未知物:处理样品

3.柱未平衡:重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对色谱)

4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱):每一天新配,用抗氧化剂

5.水污染(反相):路程经过过程变化平衡时间查抄水质量,用HPLC级的水

(六)基线噪声

可能的原因:解决方法

1.气泡(锋利峰):流动相脱气,加柱后背压

2.污染(随机噪声):清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂

3.检测器灯连续噪声:改换氘灯

4.电干扰(偶然噪声):采用稳压电源,查抄干扰的来历(如水浴等)

5.检测器中有气泡:流动相脱气,加柱后背压

(七)峰拖尾

可能的原因:解决方法

1.柱超载:降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相

2.峰干扰:清洁样品,调整流动相

3.硅羟基作用加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品

4.同前(四)4:同前(四)4 5.同前(四)3 5.:同前(四)3 6.死体积或柱外体积过大:毗连点降至最低,对所有毗连点作合适调整,尽可能采用细内径的毗连管

7.柱效降落:用较低腐蚀前提,改换柱,采用保护柱

(八)峰展宽

可能的原因:解决方法

1.进样体积过大:同(四)1 2.在进样阀中造成峰扩展:进样前后排出气泡以降低扩散

3.数据系统采样速率太慢:设定速率应是每一峰大于10点

4.检测器时间常数过大:设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%

5.流动相粘度过高:增加柱温,采用低粘度流动相

6.检测池体积过大:用小体积池,卸下热交换器

7.保留时间过长:等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱

8.柱外体积过大:将毗连管径和毗连管长度降至最小

9.样品过载:进小浓度小体积样品

液相色谱柱使用及保养液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成,其中液相色谱柱的不错安装和使用,是液相色谱工作的关键;也是液相色谱工作者获患上不错可靠的实验数据的必经之路。

一、液相色谱柱的安装:

1、液相色谱柱的布局:

a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。

柱接头采用低死体积布局,柱接头是两端螺纹组件,一端是为7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(海内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)毗连,中间放置压坏用于弥缝。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的毗连管毗连,中间也放置压环用于柱接头的弥缝。为了尽量减少柱外死体积,在安装色谱柱时,用Φ1.57mm毗连管路程经过过程空心螺钉压环后要尽量插到尽头,然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在毗连管上(毗连管路程经过过程压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。

在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316#不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及毗连管内不能长时间存留此类溶剂,以免腐蚀。

b、柱填料:

液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间举行的,柱子的分类是依据填料类型而定。

正相柱:多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种,其颗粒直径在3-10μm的范围内。另一类正相填料是硅胶外貌键合-CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。

反相柱:主要是以硅胶为基质,在其外貌键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。也有无定型和球型之分。

经常使用的其他的反相填料还有键合C8、C四、C二、苯基等,其颗粒粒径在3-10μm之间。

2,色谱柱的安装:

a、拆开柱包装盒,明确承认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。

b、拧下柱两端接头的弥缝堵头放回包装盒供备用。

c、按柱管上标示的流动相流向,将色谱柱的进口端路程经过过程毗连管与进样阀出口相毗连(如前提允许,建议在柱前使用保护柱);柱的出口与检测器毗连。毗连管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。毗连管的两端均有空心螺钉及弥缝用压环。在接管时一定要设法降低柱外死体积。毗连管路程经过过程空心螺钉、压环后尽量用力插到尽头,然后顺时针拧紧空心螺钉,直至拧不动为止,再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈,切记不要用力过大。如色谱柱路程经过过程流动相加压后有漏液现象,请用扳手继续顺时针拧1/4圈,直至不漏液为止。

二、液相色谱柱的使用:

色谱柱在使用前,最好举行柱的性能测试,并将成果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等前提的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的前提举行(出厂测试所使用的前提是最佳前提),只有这样,测患上的成果才有可比性。

1、样品的前处理:

a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

二、流动相的配制:

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而到达分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点:

a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

c、流动相的黏度要尽量小,以便在使用较长的分析柱时能患上到好的分离效果;同时降低柱压降,延长液体泵的使用生存的年限(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器,最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法举行。

f、在流动相配制好后,一定要举行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测,还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

3、流动相流速的选择:

因柱效是柱中流动相线性流速的函数,使用不同的流速可患上到不同的柱效。对于一根特别指定的色谱柱,要追求最佳柱效,最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱,流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min为佳。

当选用最佳流速时,分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时,可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

注意:

a.由于甲醇价格低廉,对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。

b.对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相,没有提纯的己烷不患上使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧),去离子水及双蒸水中含有酚类杂质,有可能影响分析成果。

c.含水流动相最奸在实验前配制,尤其是夏安琪儿用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好插手叠氮化钠,防止细菌生长。

d.流动相要求使用0.45μm滤膜过滤,除去微粒杂质。

e.使用HPLC级溶剂配制流动相,使用合适的流动相可延长色谱柱的使用生存的年限,提高柱性能。

四、柱性能测试:

启动液相色谱仪:a、流动相流速设定为1ml/min。

b、UV检测器波长设定为254nm。

使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。

记录并计算测试成果。

*参考(标准小鸡鸡5226-91)液相色谱仪测试用标准色谱柱。

高压液相色谱HPLC培训教程(一)I.概括论述

一、液相色谱理论发展简况

色谱法的分离原理是:溶于流动相(mobile phase)中的各组分颠末固定相时,由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中停留不动时间不同,从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。

色谱法最先是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的,色谱法(Chromatography)因之患上名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。

液相色谱法开始阶段是用大直径的试管柱在室温和常压下用液位差输送流动相,称为经典液相色谱法,此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography,HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography,HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography,HSLP)。也称现代液相色谱。

二、HPLC的特点和优点

HPLC有以下特点:

高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每一米降压为75Kg/cm2以上。

高速-流速为0.1~10.0ml/min。

高效-可达5000塔板每一米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时耗损样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点:

速度快-通常分析一个样品在15~30min,有些样品甚至在5min内即可完成。

分辨率高-可选择固定相和流动相以到达最佳分离效果。

灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng,荧光和电化学检测器可达0.1pg。

柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少,容易回收-样品颠末色谱柱后不被破坏,可以网络单一组分或做制备。

三、色谱法分类

按两相的物理状况可分为:气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法合用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC),其中以GLC应用最广。液相色谱法合用于分离低挥发性或非挥发性、热不变性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC),它以超临界流体(界于气体和液体之间的一种物相)为流动相(经常使用CO2),因其扩散系数大,能很快到达平衡,故分析时间短,特别合用于手性化合物的拆分。

按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC,又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗入色谱法(GPC)和亲和色谱法,此外还有电泳。按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。

四、色谱分离原理

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

1.液固色谱法

使用固体吸附剂,被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。经常使用的吸附剂为硅胶或氧化铝,粒度5~10μm。合用于分离分子量200~1000的组分,大多数用于非离子型化合物,离子型化合物易产生拖尾。经常使用于分离同分异构体。

2.液液色谱法

使用将特别指定的液态物质涂于担体外貌,或化学键合于担体外貌而形成的固定相,分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。

涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相必须预先用固定相饱和,以减少固定相从担体外貌流失;温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化;另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和网络复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失,现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相,如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。

液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。

正相色谱法

采用极性固定相(如聚甘醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷),常插手乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。经常使用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等)。

反相色谱法

一般用非极性固定相(如C18、C8);流动相为水或缓冲液,常插手甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。合用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛,据统计,它占整个HPLC应用的80%左右。

随着柱填料的快速发展,反相色谱法的应用范围逐渐扩展,现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离,经常使用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5(2~8),太高的pH值会使硅胶溶解,太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。

正相色谱法与反相色谱法比较表

正相色谱法反相色谱法

固定相极性高~中中~低

流动相极性低~中中~高

组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出

从上表可看出,当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线(如氨基键合固定相)。

3.离子交换色谱法

固定相是离子交换树脂,经常使用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架,在外貌未端芳环上接上羧基、磺酸基(称阳离子交换树脂)或季氨基(阴离子交换树脂)。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有不异电荷的离子及被测组分的离子举行可逆交换,根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸万有引力而分离。

缓冲液经常使用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外,它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度,进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大,则离子强度高,倒霉于样品的解离,导致样品较快流出。

离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。

4.离子对色谱法

又称偶离子色谱法,是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后,在非极性固定相中溶解度增大,从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。

分析碱性物质经常使用的离子对试剂为烷基磺酸盐,如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。

分析酸性物质经常使用四丁基季铵盐,如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。

离子对色谱法经常使用ODS柱(即C18),流动相为甲醇-水或乙腈-水,水中插手3~10mmol/L的离子对试剂,在一定的pH值范围内举行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。

5.排阻色谱法

固定相是有一定孔径的多孔性填料,流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中,停留不动时间长;大分子量的化合物不能进入孔中,直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。经常使用于分离高分子化合物,如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。

高压液相色谱HPLC培训教程(二)II.基本概念和理论

一、基本概念和术语

1.色谱图和峰参数

色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器,所患上到的信号-时间曲线,又称色谱流出曲线(elution profile)。

基线(base line)--经流动相冲洗,柱与流动相到达平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。

噪音(noise)--基线信号的颠簸。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不不变、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。

漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作前提如电压、温度、流动相及流量的不不变所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。

色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰类似于对称形正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种:前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。

拖尾因子(tailing factor,T),用以权衡色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。《中国药典》划定T应为0.95~1.05。T1.05为拖尾峰。

峰底-基线上峰的起航点至终点的距离。

峰高(peak height,h)-峰的最高点至峰底的距离。

峰宽(peak width,W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ

半峰宽(peak width at half-height,Wh/2)-峰高一半处的峰宽。Wh/2=2.355σ

标准偏差(standard deviation,σ)-正态分布曲线x=±1时(拐点)的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小,分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;反之,σ大,峰形胖、柱效低。

峰面积(peak area,A)-峰与峰底所包围的面积。

2.定性参数(保留值)

死时间(dead time,t0)--不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)路程经过过程色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。

死体积(dead volume,V0)--由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分:进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据,Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程,其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展,这3部分体积应尽量减小。V0=F×t0(F为流速)

保留时间(retention time,tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度泼天值的时间。

保留体积(retention volume,VR)--从进样开始到某组分在柱后出现浓度泼天值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=F×tR

调整保留时间(adjusted retention time,t'R)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验前提(温度、固定相称)一定时,t'R只取决组分的性质,因此,t'R(或tR)可用于定性。t'R=tR-t0

调整保留体积(adjusted retention volume,V'R)--扣除死体积后的保留体积。

3.柱效参数

理论塔板数(theoretical plate number,N)--用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。

N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。在一张多组分色谱图上,如果各组分含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低。

用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和经常使用,因为半峰宽更易精确测定,尤其是对稍有拖尾的峰。

N与柱长成正比,柱越长,N越大。用N表示柱效时应注明柱长,如果未注明,则表示柱长为1米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在1000以上。)

若用调整保留时间(t'R)计算理论塔板数,所患上值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)。

理论塔板高度(theoretical plate height,H)--每一单位柱长的方差。实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算。

4.相平衡参数

分配系数(distribution coefficient,K)--在一定温度下,化合物在两相间到达分配平衡时,在固定相与流动相中的浓度之比。

分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关,也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中,K有不同的概念:吸附色谱法为吸附系数,离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数),凝胶色谱法为渗入参数。但一般情况可用分配系数来表示。

在前提(流动相、固定相、温度和压力等)一定,样品浓度很低时(Cs、Cm很小)时,K只取决于组分的性质,而与浓度无关。这只是理想状况下的色谱前提,在这类前提下,患上到的色谱峰为正常峰;在很多情况下,随着浓度的增大,K减小,这时色谱峰为拖尾峰;而有时随着溶质浓度增大,K也增大,这时色谱峰为前延峰。因此,只有尽可能减少进样量,使组分在柱内浓度降低,K永恒固定时,才能获患上正常峰。

在同一色谱前提下,样品中K值大的组分在固定相中停留不动时间长,后流出色谱柱;K值小的组分则停留不动时间短,先流出色谱柱。混合物中各组分的分配系数相差越大,越容易分离,因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。

在HPLC中,固定相确定后,K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值,以获患上组分间的分配系数差异及相宜的保留时间,到达分离的目的。

容量因子(capacity factor,k)--化合物在两相间到达分配平衡时,在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。

容量因子的物理意义:表示一个组分在固定相中逗留的时间(t'R)是不保留组分保留时间(t0)的几倍。k=0时,化合物全部存在于流动相中,在固定相中不保留,t'R=0;k越大,说明固定相对此组分的容量越大,出柱慢,保留时间越长。

容量因子与分配系数的不同点是:K取决于组分、流动相、固定相的性质及温度,而与体积Vs、Vm无关;k除了与性质及温度有关外,还与Vs、Vm有关。由于t'R、t0较Vs、Vm易于测定,以是容量因子比分配系数应用更广泛。

选择性因子(selectivity factor,α)--相邻两组分的分配系数或容量因子之比。α又称为相对保留时间(《美国药典》)。

要使两组分患上到分离,必须使α≠1。α与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关,与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来讲,α的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异,即分子间互动力的差异。

5.分离参数

分离度(resolution,R)--相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率,表示相邻两峰的分离程度。R=。当W1=W2时,R=。当R=1时,称为4σ分离,两峰基本分离,赤露峰面积为95.4%,内侧峰基重叠约2%。R=1.5时,称为6σ分离,赤露峰面积为99.7%。R≥1.5称为完全分离。

中国药典划定R应大于1.5。

提高分离度有三种途径:①增加塔板数。方法之一是增加柱长,但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度,提高柱效。②增加选择性。当α=1时,R=0,不管柱效有多高,组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性:a.改变流动相的组成及pH值;b.改变柱温;c.改变固定相。③改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法,可以路程经过过程调节流动相的组成来使成为事实。k2趋于0时,R也趋于0;k2增大,R也增大。但k2不能太大,否则不单分离时间延长,而且峰形变宽,会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在1~10范围内,最好为2~5,窄径柱可更小些。

高压液相色谱HPLC培训教程(三)二、塔板理论

1.塔板理论的基本假设

塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。它把色谱柱看作分馏塔,把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程,即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。塔板理论的基本假设为:

1)色谱柱内存在很多塔板,组分在塔板间隔(即塔板高度)内完全从命分配定律,并很快到达分配平衡。

2)样品加在第0号塔板上,样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。

3)流动相在色谱柱内间歇式流动,每一次进入一个塔板体积。

4)在所有塔板上分配系数相称,与组分的量无关。

虽则以上假设与实际色谱过程不符,如色谱过程是一个动态过程,很难到达分配平衡;组分沿色谱柱轴方向的扩散是必然性的。可是塔板理论导出了色谱流出曲线方程,成功地解释了流出曲线的形状、浓度泼天点的位置,能够评价色谱柱柱效。

2.色谱流出曲线方程及定量参数(峰高h和峰面积A)

由色谱流出曲线方程可知:当t=tR时,浓度C有泼天值。Cmax就是色谱峰的峰高。因此:①当实验前提一定时(即σ一定),峰高h与组分的量C0(进样量)成正比,以是正常峰的峰高可用于定量分析。②当进样量一定时,σ越小(柱效越高),峰高越高,因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。

由流出曲线方程对V(0~∞)求积分,即患上出色谱峰面积A。可见A相当于组分进样量C0,因此是经常使用的定量参数。把Cmax=h和Wh/2=2.355σ代入上式,即患上A=1.064×Wh/2×h,此为正常峰的峰面积计算公式。

三、速率理论(又称随机模型理论)

1.液相色谱速率方程

1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念,并把影响塔板高度的动力学因素联合起来,提出了色谱过程的动力学理论--速率理论。它把色谱过程看作一个动态非平衡过程,研究过程中的动力学因素对峰展宽(即柱效)的影响。

后来Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程(后称气相色谱速率方程)的基础上,根据液体与气体的性质差异,提出了液相色谱速率方程(即Giddings方程).

2.影响柱效的因素

1)涡流扩散(eddy diffusion)。由于色谱柱内填充剂的几何布局不同,分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。涡流扩散项A=2λdp,dp为填料直径,λ为填充不规则因子,填充越不均匀λ越大。HPLC经常使用填料粒度一般为3~10μm,最好3~5μm,粒度分布RSD≤5%。但粒度过小难于填充均匀(λ大),且会使柱压过高。大而均匀(球形或近球形)的颗粒容易填充规则均匀,λ越小。总的说来,应采用细而均匀的载体,这样有助于提高柱效。毛细管无填料,A=0。

2)分子扩散(molecular diffusion)。又称纵向扩散。由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度,导致轴向扩散而引起的峰展宽。分子扩散项B/u=2γDm/u。u为流动相线速度,分子在柱内的停留不动时间越长(u小),展宽越严重。在低流速时,它对峰形的影响较大。Dm为分子在流动相中的扩散系数,由于液相的Dm很小,通常仅为气相的10-4~10-5,因此在HPLC中,只要流速不太低的话,这一项可以忽略不计。γ是考虑到填料的存在使溶质分子不能自由地轴向扩散,而引入的柱参数,用以对Dm举行校正。γ一般在0.6~0.7左右,毛细管柱的γ=1。

3)传质阻抗(mass transfer resistance)。由于溶质分子在流动相、静态流动相和固定相中的传质过程而导致的峰展宽。溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、转移的过程并不是瞬间到达平衡,实际传质速度是有限的,这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状况下工作,从而产生峰展宽。液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。

①流动相传质阻抗Hm=Cmd2pu/Dm,Cm为常数。这是由于在一个流路中流路中心和边缘的流速不等所致。接近填充颗粒的流动相流速较慢,而中心较快,处于中心的分子还未来患上及与固定相到达分配平衡就随流动相前移,故而产生峰展宽。

②静态流动相传质阻抗Hsm=Csmd2pu/Dm,Csm为常数。这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中,晚回到流路中而引起峰展宽。Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。固定相的颗粒越小,微孔孔径越大,传质阻力就越小,传质速率越高。以是改进固定相布局,减小静态流动相传质阻力,是提高液相色谱柱效的关键。

Hm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p成正比,与扩散系数Dm成反比。因此应采用低粒度固定相和低粘度流动相。高柱温可以增大Dm,但用有机溶剂作流动相时,易产生气泡,因此一般采用室温。

③固定相传质阻抗Hs=Csd2fu/Ds(液液分配色谱),Cs为常数,df为固定液的液膜厚度,Ds为分子在固定液中的扩散系数。在分配色谱中Hs与df的平方成正比,在吸附色谱中Hs与吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中,Hs才有明显影响。采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。

从速率方程式可以看出,要获患上高效能的色谱分析,一般可采用以下措施:①进样时间要短。②填料粒度要小。③改善传质过程。过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾,甚至不可逆吸附。④适当的流速。以H对u作图,则有一最佳线速度uopt,在此线速度时,H最小。一般在液相色谱中,uopt很小(约莫0.03~0.1mm/s),在这样的线速度下分析样品需要多时,一般来讲都选在1mm/s的前提收操作。⑤较小的检测器死体积。

3.柱外效应

速率理论研究的是柱内峰展宽因素,实际在柱外还存在引起峰展宽的因素,即柱外效应(色谱峰在柱外死空间里的扩展效应)。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和,即:

σ2=σ2柱内+σ2柱外+σ2其它柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应,首先应尽可能减少柱外死体积,如使用"零死体积接头"毗连各部件,管道对接宜呈流线形,检测器的内体腔积应尽可能小。研究表明柱外死体积之和应5mm;⑤实验室制备柱,内径20~40mm,柱长10~30cm;⑥出产制备柱内径可达几十厘米。柱内径一般是根据柱长、填料粒径和折合流速来确定,目的是为了避免管壁效应。

2.柱的发展方向

因夸大分析速度而发展出短柱,柱长3~10cm,填料粒径2~3µm。为提高分析灵敏度,与质谱(MS)联接,而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于0.2mm的微径柱(microbore)。细管径柱的优点是:①节省流动相;②灵敏度增加;③样品量少;④能使用长柱到达高分离度;⑤容易控制柱温;⑥易于使成为事实LC-MS联用。

但由于柱体积越来越小,柱外效应的影响就更加显著,需要更小池体积的检测器(甚至采用柱上检测),更小死体积的柱接头和毗连部件。配套使用的设备应具备如下性能:输液泵能精密输出1~100µl/min的低流量,进样阀能精确、重复地进样微小体积的样品。且因上样量小,要求高灵敏度的检测器,电化学检测器和质谱仪在这方遮挡面部的东西有突出优点。

3.柱的填充和性能评价

色谱柱的性能除了与固定相性能有关外,还与填充技术有关。在正常前提下,填料粒度>20µm时,干法填充制备柱较为合适;颗粒